Abwiz Bio，我們開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了一個(gè)三階段抗體親和力成熟平臺(tái)，該平臺(tái)涉及三個(gè)獨(dú)立的文庫(kù)構(gòu)建和選擇/篩選步驟。在每個(gè)篩選步驟之后，將工程克隆整合在一起，用于隨后的文庫(kù)構(gòu)建。在階段1中使用六個(gè)單獨(dú)的CDR靶向文庫(kù)可以使我們探索大的序列空間。在每個(gè)階段對(duì)工程克隆的篩選和測(cè)序，使我們能夠監(jiān)控進(jìn)度，并提供有用的信息，有助于后續(xù)的文庫(kù)設(shè)計(jì)。

由于每種抗體的起始親和力和序列以及抗原的性質(zhì)對(duì)于每個(gè)項(xiàng)目都不同，因此很難預(yù)先預(yù)測(cè)親和力成熟的一階段是否令人滿意，或者是否需要親和力成熟的第二和第三階段。因此，在每個(gè)階段的后，我們將介紹已完成的工作并與每個(gè)客戶進(jìn)行公開(kāi)討論，以確保他們滿意并確定項(xiàng)目的后續(xù)步驟。

 STEAM（增強(qiáng)階段親和力成熟度）技術(shù)

abwizbio新穎的三階段工程平臺(tái)

我們的團(tuán)隊(duì)在設(shè)計(jì)用于基于噬菌體的選擇的合成文庫(kù)方面擁有數(shù)十年的集體經(jīng)驗(yàn)。Abwiz Bio領(lǐng)導(dǎo)了多次成功的親和力成熟活動(dòng)，為具有低納摩爾起始親和力的人，小鼠和兔抗體產(chǎn)生了> 10倍的親和力改善。我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種穩(wěn)健的親和力成熟方案，該方案始于分別針對(duì)六個(gè)CDR進(jìn)行誘變。我們的多階段方法涵蓋了更多的多樣性，并產(chǎn)生了更高的親和力克隆，而這是傳統(tǒng)的方法（如CDR步移）無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

階段1	第二階段	第三階段
6個(gè)CDR靶向庫(kù)	L1 + L2 + L3和H1 + H2 + H3合并在單獨(dú)的庫(kù)中	組合式H + L
通過(guò)構(gòu)建針對(duì)每個(gè)CDR的獨(dú)立文庫(kù)，我們對(duì)大序列空間進(jìn)行了采樣	預(yù)先選擇的CDR庫(kù)合并在一起以創(chuàng)建單獨(dú)的LC / HC庫(kù)	終的文庫(kù)對(duì)預(yù)先選擇了重庫(kù)和輕庫(kù)，以獲得高的親和力克隆

依靠經(jīng)驗(yàn)豐富的團(tuán)隊(duì)來(lái)設(shè)計(jì)您的圖書(shū)館

抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）與抗原形成大部分結(jié)合表面。CDR包含三個(gè)環(huán)，分別從每個(gè)抗體臂可變區(qū)內(nèi)的重鏈（CDR H1，H2和H3）和輕鏈（CDR L1，L2和L3）延伸?？梢酝ㄟ^(guò)針對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行誘變來(lái)改善親和力。但是，噬菌體展示的生物學(xué)限制（大大腸桿菌的限制轉(zhuǎn)換效率）將給定庫(kù)中可能的變體總數(shù)限制為?1E + 10。（與酵母展示相比，庫(kù)的大小要大得多，大?1E + 08）。對(duì)所有可能的變體隨機(jī)分配一個(gè)6個(gè)氨基酸的片段，可產(chǎn)生1.07E + 09的理論多樣性；因此，理論多樣性可以成倍地超過(guò)實(shí)際圖書(shū)館的多樣性。通過(guò)靶向單獨(dú)文庫(kù)中的每個(gè)CDR，可以針對(duì)階段1中的每個(gè)單獨(dú)環(huán)優(yōu)化抗原相互作用。

對(duì)于每個(gè)CDR，使用生物信息學(xué)方法選擇假定對(duì)于抗原結(jié)合而言不是理想的氨基酸。通過(guò)將您的序列與抗體種系和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，我們可以推斷出哪些位置可能已經(jīng)針對(duì)抗原結(jié)合進(jìn)行了優(yōu)化，哪些可以耐受突變。我們過(guò)去在成功開(kāi)展人類和小鼠治療候選藥物方面的經(jīng)驗(yàn)，也為我們的選擇提供了依據(jù)。我們將總文庫(kù)大小限制在理論多樣性極限內(nèi)，同時(shí)避免了會(huì)破壞全局抗體穩(wěn)定性的突變和程度地采樣序列圖。

抗原結(jié)合克隆的CDR H1和H2序列以序列徽標(biāo)格式顯示。值得注意的是，（1）僅在設(shè)計(jì)用于誘變的每個(gè)位置上發(fā)現(xiàn)了氨基酸；（2）與階段1相比，階段2克隆具有更強(qiáng)的序列收斂性；（3）在親和力成熟的庫(kù)中存在高度多樣性。

基于噬菌體的選擇的好處

噬菌體選擇非常靈活，可以調(diào)整以獲得所需的抗原特異性或親和力參數(shù)。選項(xiàng)包括（1）與陰性對(duì)照抗原競(jìng)爭(zhēng)對(duì)交叉反應(yīng)性結(jié)合劑的陰性選擇；（2）通過(guò)以較低濃度包被抗原和/或通過(guò)改變孵育和洗滌時(shí)間進(jìn)行嚴(yán)格選擇，以進(jìn)行基于速率的動(dòng)力學(xué)選擇，（3）抗原構(gòu)象特異性選擇與重組和基于細(xì)胞的抗原都兼容，后（4）噬菌體病毒在80°C穩(wěn)定，可以選擇熱穩(wěn)定的高表達(dá)克隆。

我們專有的載體與Fab噬菌體和可溶性Fab生產(chǎn)均兼容，可在噬菌體淘選后進(jìn)行快速篩選。選擇后，產(chǎn)生數(shù)百個(gè)隨機(jī)挑選的克隆，并從細(xì)菌上清液中篩選為可溶性Fab。在進(jìn)入昂貴，費(fèi)時(shí)的IgG生產(chǎn)階段之前，篩選高通量的潛在候選基因可以節(jié)省大量時(shí)間和資源。除了全序列分析外，還可以通過(guò)ELISA，流式細(xì)胞儀，功能分析和SPR高通量篩選針對(duì)重組蛋白或基于細(xì)胞的蛋白的Fab 。

我們的協(xié)議已經(jīng)過(guò)嚴(yán)格驗(yàn)證

我們的三階段工程策略被用于提高與識(shí)別潛在癌癥靶標(biāo)的候選抗體候選物的親和力。在每個(gè)階段鑒定的工程克隆的測(cè)序分析為我們的3階段策略提供了有力的支持。

篩選過(guò)程中鑒定出的*CDR數(shù)如下所示。（CDR數(shù)）/（CDR總數(shù)）顯示每個(gè)篩選階段每個(gè)CDR的所選克隆的序列多樣性。

在先前的選擇回合中識(shí)別出的CDR的數(shù)量如下所示。這顯示了具有先前在階段1（或階段1和2）中鑒定的CDR序列的克隆數(shù)。

在每個(gè)階段的篩選步驟中均一致鑒定出*的CDR序列。傳統(tǒng)的CDR步移協(xié)議 （在繼續(xù)設(shè)計(jì)下一個(gè)CDR之前，從單個(gè)文庫(kù)中選擇宜CDR克?。皇鞘褂梦覀兊姆椒▉?lái)組合整個(gè)預(yù)選CDR庫(kù)以進(jìn)行其他文庫(kù)選擇，將無(wú)法確定宜方法。候選人。這些數(shù)據(jù)為我們的三階段工程策略提供了有力的支持。

展示成功

申請(qǐng)治療

在一個(gè)客戶項(xiàng)目中，我們成功地將親和力提高了10倍，與pM K D的結(jié)合力提高了，同時(shí)又增加了候選治療藥物的功能。使用了兩階段方法（單個(gè)CDR→組合的H + L文庫(kù)），并且在進(jìn)一步的臨床研究之前就宜工程克隆的序列。

與親本野生型相比，工程化Fab的解離速率更慢，這表明通過(guò)SPR分析提高了親和力。

提供給客戶數(shù)十名工程候選人

在另一個(gè)客戶項(xiàng)目中，我們通過(guò)詳盡的3階段方法（單個(gè)CDR→單獨(dú)的H + L→組合的H + L庫(kù)）將親和力提高了10-100倍。我們向客戶提供了23個(gè)經(jīng)過(guò)工程設(shè)計(jì)的候選物用于IgG功能篩選，每個(gè)候選物具有*的序列并大大提高了親和力。

上面顯示了在每個(gè)工程階段之后進(jìn)行的Fab篩選的克隆。第1階段克隆顯示出比野生型更高的親和力，但仍保留更快的解離速率。從第2階段庫(kù)獲得較低的失效率。只有在第3階段工程后才能獲得具有飽和結(jié)合和非常慢的脫模速率的克隆。

我們靈活的平臺(tái)可滿足您的需求

僅在第1階段工程（單個(gè)CDR庫(kù)）或第2階段（僅重鏈或輕鏈庫(kù)）后，才能確定親和力的充分提高。在一個(gè)項(xiàng)目中，我們的客戶對(duì)第2階段后的結(jié)果感到滿意。我們的靈活平臺(tái)包括每個(gè)工程階段之后的Fab特性鑒定，從而使我們的客戶可以通過(guò)在多個(gè)點(diǎn)評(píng)估項(xiàng)目成果來(lái)節(jié)省時(shí)間和資源。這使我們能夠快速提供結(jié)果，并根據(jù)需要調(diào)整我們的工程方法。

測(cè)試了階段2克隆針對(duì)親本野生型Fab和非速率ELISA中宜階段1工程改造的克隆。選自第2階段文庫(kù)的突變可顯著改善親和力。

項(xiàng)目時(shí)間表

我們開(kāi)始設(shè)計(jì)您的文庫(kù)所需要的只是抗體的氨基酸序列。一步，合成用于文庫(kù)構(gòu)建的抗體基因和寡核苷酸，通常在基因合成后約2個(gè)月完成階段1工程。第2階段和第3階段分別可以在4-6周內(nèi)完成，因?yàn)樗鼈兛梢粤⒓催M(jìn)行庫(kù)合成步驟。因?yàn)槊總€(gè)項(xiàng)目都是*的，所以我們?cè)诿總€(gè)階段的開(kāi)始都與每個(gè)客戶緊密合作，以仔細(xì)審查先前的篩選數(shù)據(jù)并制定可靠的計(jì)劃。