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PhyNexus PTV 92-20-01說明書

PhyNexus開發(fā)了一種*的技術(shù)，用于工程蛋白和抗體的微量純化，使研究人員能夠定期純化和富集高達(dá)1 mL的樣品。PhyTip™色譜柱的*設(shè)計(jì)使洗脫體積低至10μL，從而產(chǎn)生高達(dá)50 x的富集因子，純化蛋白濃度高達(dá)5 mg / ml。

純化和富集的過程是簡(jiǎn)單的三步技術(shù)，其中首先捕獲感興趣的蛋白質(zhì)，然后純化并終富集。整個(gè)過程可能需要不到15分鐘的時(shí)間來生成高濃度的全功能蛋白質(zhì)，可供進(jìn)一步分析。

• IgG回收率為70-90％
• 獲得高度濃縮的純化蛋白質(zhì)
• 蛋白質(zhì)A PhyTip柱顯示從不同水平的背景蛋白質(zhì)中提取具有非常高純度的IgG蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)A PhyTip柱顯示出功能性抗體（IgG）的高結(jié)合親和力和高容量親和純化。

蛋白A柱采用我們專有的  雙流色譜，可  提供完整的抗體結(jié)合和高終濃度。PhyTip色譜柱兼容大多數(shù)8,12和96通道自動(dòng)化液體處理機(jī)器人，包括  Agilent Technologies，  Beckman Coulter，  Dynamic Devices，  Perkin Elmer，  Hamilton和  Tecan。

具有蛋白A的PhyTip色譜柱已針對(duì)特定PhyNexus試劑和儀器流速/體積進(jìn)行了優(yōu)化，如下所示。使用PhyNexus純化系統(tǒng)收集該信息。帶有蛋白A的所有PhyTip色譜柱都配有推薦的PhyTip緩沖液，包括：捕獲緩沖液 - 用于需要添加額外緩沖液以補(bǔ)充樣品體積并確保捕獲正確pH值的情況。洗滌緩沖液I - 磷酸鹽緩沖溶液pH 7.4洗滌緩沖液II - 鹽水溶液。注意：沒有緩沖能力以確保有效洗脫富集緩沖液 - 用于終洗脫步驟 - 磷酸鹽緩沖溶液pH 2.5中和緩沖液。 - Tris緩沖溶液pH 9.0注意：富集緩沖液以4 mL pH 2.5磷酸鹽緩沖溶液的形式提供，

含有蛋白A樹脂的200多個(gè)PhyTip色譜柱：

對(duì)于含有1mg BSA的5μgIgG2a（抗FITC MAb。）的200μL樣品，使用下面顯示的條件處理，在終樣品體積中回收大于40％的原始IgG質(zhì)量。此外，通過用考馬斯檢測(cè)的SDS-PAGE測(cè)定，回收的IgG純度超過95％。

捕獲：通過樹脂床以250μL/分鐘的流速通過樹脂床捕獲200μL樣品。

純化：200μLPhyNexus蛋白A洗滌緩沖液I，以500μL/ min的流速通過樹脂床兩個(gè)循環(huán)，然后用洗滌緩沖液II進(jìn)行第二次洗滌，在樹脂床上通過流動(dòng)兩個(gè)循環(huán)速率為500μL/ min。

富集：用10μLPhyNexusProtein A Enrichment Buffer將蛋白質(zhì)洗脫到溶液中，以500μL/ min的流速通過樹脂床5個(gè)循環(huán)。用3μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

出廠時(shí)含有的蛋白G富集緩沖液含有：111mM NaH2PO4,140mM NaCl，14.8mM H3PO4，pH3.0

含有蛋白A樹脂的1000多種PhyTip色譜柱：

對(duì)于含有5μgBSA的10μgIgG2a（抗FITC MAb。）的500μL樣品，使用下面顯示的條件處理，在終樣品體積中回收大于40％的原始IgG質(zhì)量。此外，通過用考馬斯檢測(cè)的SDS-PAGE測(cè)定，回收的IgG純度超過95％。

捕獲：通過樹脂床以250μL/分鐘的流速通過四個(gè)循環(huán)捕獲500μL樣品。

純化：1000μLPhyNexusProtein G洗滌緩沖液I，以500μL/ min的流速通過樹脂床兩個(gè)循環(huán)，然后用洗滌緩沖液II進(jìn)行第二次洗滌，以500的流速通過樹脂床兩個(gè)循環(huán)。 μL/分鐘。

富集：用15mL PhyNexus蛋白A富集緩沖液將蛋白質(zhì)洗脫到溶液中，以500μL/ min的流速通過樹脂床5個(gè)循環(huán)。用5μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

蛋白質(zhì)APhyTip®色譜柱的性能特征和分析程序

介紹

PhyNexusPhyTip®色譜柱是創(chuàng)新的純化工具，可從根本上簡(jiǎn)化各種來源的蛋白質(zhì)的捕獲，純化和富集。這些凈化工具成功的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)保留親和樹脂床的機(jī)制，具有小的死體積和大的捕獲潛力。一組PhyTipcolumns包含蛋白A，以在特定適條件下特異性結(jié)合來自不同來源的抗體（IgG），從而允許去除核酸和其他污染物。在快速洗滌步驟后，用常用的低pH緩沖液容易地洗脫純化的抗體。該技術(shù)允許特別高產(chǎn)率的IgG，這取決于各種條件，并且在非常高濃度的載體蛋白如BSA的存在下提供高度選擇性的純化。PhyTip色譜柱具有*的結(jié)合能力，可以結(jié)合超過100μg的IgG，并且可以有效回收少至200 ng的IgG - 代表近三個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍。PhyTip色譜柱非常適用于從雜交瘤上清液中篩選抗體或用于高通量提取和純化親和標(biāo)記蛋白。

績(jī)效和分析程序

IgG以高親和力和特異性結(jié)合蛋白A. 這種相互作用的強(qiáng)度和選擇性使蛋白A能夠有效地從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中純化IgG。為了檢測(cè)PhyTip柱與蛋白A樹脂的性能，測(cè)量了使用1000+蛋白A PhyTip柱的純化IgG（抗FITC-MAb）的回收百分比。

材料和方法

樣品：10μgmFITC-MAb（IgG2a亞類）在0.5ml 
含有5mg BSA的PBS中，或
2.含有10％FBS（胎牛血清）的DMEM ，或含有5mg BSA的3.SFM 
（無血清培養(yǎng)基）
樣品處理：使用以下方案在半自動(dòng)ME 1000平臺(tái)上處理所有樣品：

1. （1）捕獲：通過將樣品通過樹脂床進(jìn)行2個(gè)輸入/輸出循環(huán)（體積編程為0.6ml，0.25ml / min）來捕獲特定蛋白質(zhì)。
2. （2）純化：通過用0.5mL PBS（洗滌緩沖液I）進(jìn)行1個(gè)輸入/輸出循環(huán)（體積編程為0.6ml，0.5ml / min）洗滌結(jié)合的蛋白質(zhì)/親和樹脂，然后進(jìn)行1個(gè)輸入/輸出循環(huán)，去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)（體積為0.6ml，0.5ml / min），用0.5mL鹽水溶液（洗滌緩沖液II）。
3. （3）富集：用15μLpH3.0洗脫緩沖液以4次進(jìn)/出循環(huán)（體積編程為0.1-0.15ml，1ml / min）洗脫IgG2a。洗脫后，加入5μL中和緩沖液。注意，由PhyNexus提供的蛋白A和蛋白G PhyTip柱的當(dāng)前洗脫緩沖液具有2.5的pH，并且當(dāng)前的中和緩沖液的pH為9.0。

定量程序

（1）為了制備還原的IgG2a，使15μl終洗脫體積與5μl新制備的TCEP（15μl10mg/ ml TCEP在水中反應(yīng)，終體積為30μl）反應(yīng)。

（2）使用HP 1050 HPLC系統(tǒng)將20μl還原的IgG2a注入無孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶劑A（水中0.1％TFA）和溶劑B（ACN中0.1％TFA）之間的梯度為25％至75％，使用5分鐘。檢測(cè)：214和280nm的UV。

1. （3）T wo主要IgG2a峰在3.18和3.34分鐘左右洗脫。在每種情況下，將這兩個(gè)峰下面積從（3.3-13.5）min積分，并在214nm處記錄相應(yīng)的峰面積。
2. （4）將相同反應(yīng)條件下的TCEP處理的IgG2a標(biāo)準(zhǔn)品加載到柱中，并用作恢復(fù)計(jì)算的輸入或標(biāo)準(zhǔn)。

IgG2a恢復(fù)的結(jié)果

在DMEM + 10％FBS中的回收率= 77％SFM中的回收率+ 5mg BSA = 64％。

已知載體蛋白如白蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并有助于產(chǎn)生良好的抗體，因此當(dāng)產(chǎn)生抗體時(shí)它通常以高量存在。因此，任何純化和富集程序必須能夠耐受高濃度的白蛋白。此外，上面顯示的結(jié)果似乎表明高背景蛋白濃度（如BSA）的存在可能對(duì)回收率有益。

在載體蛋白存在下IgG2a回收率的再現(xiàn)性

為了驗(yàn)證載體蛋白對(duì)大IgG2a回收率的作用，并證明重現(xiàn)性，從多個(gè)樣品（n = 4）中從PBS（以及含有5mg BSA的PBS）中純化IgG2a。結(jié)果表明，在500倍過量的BSA濃度存在下，純化的IgG2a的回收率提高（至少20％或更多），并且該方法也是高度可重復(fù)的。

PBS中的回收率= 42.25％（SD = 4.66％）PBS中的回收率+ 5mg BSA = 66.5％（SD = 7.5％）

選擇性表現(xiàn)和分析程序

為了表征和驗(yàn)證蛋白A-IgG親和相互作用的選擇性，將5mg BSA作為載體蛋白添加至0.5μg樣品體積（333倍過量）中的15μgIgG。使用Protein A PhyTip柱處理樣品。

材料和方法

樣品：在0.5ml含有5mg BSA（10mg / ml或1％w / v BSA）的PBS或PBS中的15μgmFITC-MAb（IgG2a亞類）。樣品處理：如上文“恢復(fù)性能和分析程序”中所述。

IgG定量和純度分析程序：

（1）將15μl終洗脫體積分成兩部分：13μl與新制備的13μl10mg / ml TCEP（終體積=26μl和[TCEP] = 17.5 mM）在室溫下反應(yīng)~16在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中將2μl加載到凝膠上。

（2）使用HP 1050 HPLC系統(tǒng)將20μl以上26μl還原的IgG2a注入無孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶劑A（水中0.1％TFA）和溶劑B（ACN中0.1％TFA）之間的梯度為25％至75％，使用5分鐘。檢測(cè)：214和280nm的UV。

1. （3）兩個(gè)主要的IgG2a峰在3.17和3.3分鐘左右洗脫。在這兩個(gè)峰下面積在每種情況下從（3.13-3.5）min積分，并且在214nm處記錄相應(yīng)的mAU。
2. （4）將在相同反應(yīng)條件下經(jīng)TCEP處理的IgG2a標(biāo)準(zhǔn)品（注射量為1.08,2.6,4.3,6.48和8.64μgFITC-M Ab）裝入柱中并用作恢復(fù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

PhyNexus建議使用含有IgG的PhyTip入門試劑盒作為標(biāo)準(zhǔn)，以驗(yàn)證所有應(yīng)用中PhyTip色譜柱的使用。

用于純化和富集的樣品必須清澈且無顆粒物質(zhì)。在與PhyTip色譜柱一起使用之前，強(qiáng)烈建議離心樣品并僅使用澄清的上清液。

運(yùn)輸和存儲(chǔ)

每包PhyTip色譜柱均按照高標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)和質(zhì)量控制，并在保留盒中運(yùn)輸，以保持每個(gè)PhyTip色譜柱中特定親和樹脂的完整性。本產(chǎn)品在環(huán)境溫度下運(yùn)輸，但收到后應(yīng)存放在4到8℃的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室冰箱中。

• 不要冷凍或儲(chǔ)存冷凍。
• 不使用時(shí)，請(qǐng)將盒蓋關(guān)閉并密封，存放在冰箱中。
• 在干燥環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存??，不要讓親和樹脂干燥。

當(dāng)從PhyNexus運(yùn)輸時(shí)，含有蛋白A的PhyTip柱存儲(chǔ)在甘油中。

蛋白質(zhì)A PhyTip色譜柱可用于這些機(jī)器人系統(tǒng)